Pozycje Man5GlcNAc2, Man9GlcNAc2, Glc1Man9GlcNAc2 i Glc3Man9GlcNAc2 są wskazane jako M5, M9, G1 i G3. * Glc1Man5 lub Man6. Białkowe oligosacharydy (PDO) analizowano z tych samych eksperymentów. PDO zostały uwolnione przez PNGazę F z końcowych granulek po ekstrakcji chloroformem / metanolem. Ze względu na kotranslacyjne działanie glukozydazy, głównymi oligosacharydami uwalnianymi z białek komórek kontrolnych są G1Man9GlcNAc2 i Man9GlcNAc2 (Figura 3). U pacjenta są to również najliczniej występujące oligosacharydy, ale stwierdza się, że znacznie więcej skróconych postaci migruje zgodnie z oczekiwaniami dla Man5y7GlcNAc2. Jest możliwe, że te skrócone oligosacharydy mogą być glukozylowane, jak widać w komórkach CHO Lec35. Zakładając podobną kinetykę przetwarzania węglowodanów, ten wynik prawdopodobnie będzie spowodowany zwiększonym transferem skróconych oligosacharydów do komórek pacjenta, zjawisko opisane również w komórkach CHO Lec35 (2). Ponieważ uszkodzone etapy wydłużania LLO są również wadliwe w komórkach CHO Lec35, badano ludzki homolog Lec35. Sekwencjonowanie ludzkiego genu MPDU1 / Lec35. Region kodujący ludzki gen MPDU1 zsekwencjonowano z cDNA pacjenta i kontrolnych fibroblastów. Pacjent miał homozygotyczną mutację punktową 221T3C (74Leu Ser), która została potwierdzona na poziomie genomowym. Wielokrotne dopasowanie sekwencji kodujących Lec35 z różnych gatunków potwierdziło, że alifatyczne łańcuchy boczne są konserwowane w pozycji zmienionej reszty aminokwasowej (Figura 4). Mutacja wygenerowała nowe miejsce restrykcyjne TaqI. Analiza restrykcyjna eksonu 3 wykazała mutację u pacjenta, a także status heterozygotyczny jego rodziców (Figura 5). Pięćdziesiąt zdrowych europejskich dawców miało prawidłową sekwencję na obu allelach, wyłączając tę zmianę jako wspólny polimorfizm w ludzkim genie MPDU1 (nie pokazano). Figura 4 Wielokrotne dopasowanie sekwencji białka Lec35 i homologów z różnych gatunków. Regiony zachowane we wszystkich gatunkach pokazane są w czarnych skrzynkach. Szare pudełka wskazują identyczne aminokwasy w białkach ludzkich, mysich i chomiczych. Czerwone pole identyfikuje zmutowany aminokwas. Produkt genowy F38E1.9 (Caenorhabditis elegans, numer dostępu AAA83473); Produkt genowy CG3792 (Drosophila melanogaster, AAF52190.2); Białko Lec35 (Cricetulus griseus, AAG01096); Supl15h (Mus musculus, BAA78781.1) i defekt utylizacji mannozy-P-dolicholu (Homo sapiens, XP_008236.1). Figura 5 Analiza restrykcyjna TaqI eksonu 3. Mutacja 221T . C generuje miejsce restrykcyjne TaqI. Oba zmutowane allele pacjenta są cięte za pomocą TaqI (P). Jeden wycięty i jeden niecięty allel pokazuje heterozygotyczny stan rodziców (F, M). Kontrolne DNA pozostaje nieprzycięte (C). M, marker; P, pacjent; F, ojciec; M, matka; C, kontrola. Ekspresja ludzkiego MPDU1 / Lec35 w mutantach CHO Lec35. CDNA z kontroli i pacjenta sklonowano w wektorze ekspresyjnym pTre2hyg, jak opisano i wyrażono w komórkach T35-off Lec35.1 w nieobecności tetracykliny. LLO znakowano w stabilnych transfektantach przez 30 minut z [2-3H] -mannozą i goniono przez 10 minut, aby umożliwić zakończenie biosyntezy. Oligosacharydy uwolniono z ekstrahowanych LLO i analizowano metodą HPLC. Lec35.1 Komórki Tet-off transfekowane wektorem bez insertu wykazywały oczekiwany fenotyp z obciętym oligosacharydem, który został potwierdzony jako Man5GlcNAc2 przez równoległy wzorzec fluorescencyjny (Figura 6a, wektor). Rodzicielskie komórki CHO typu dzikiego miały większość znacznika w pełnej długości oligosacharydzie Glc3Man9GlcNAc2 (Figura 6d, rodzicielski CHO). Komórki CHO Lec35.1 wyrażające ludzki homolog z ich wadliwym genem wykazywały znaczną korektę fenotypu: Man5GlcNAc2 został prawie wyeliminowany, a GlcO3Man9GlcNAc2 były dominującymi oligosacharydami (Figura 6b, kontrolny cDNA). Ta prawie całkowita korekcja mannozylacji i częściowej korekcji glukozylacji była porównywalna z korektą, która wystąpiła, gdy cDNA chomika Lec35 ulegał ekspresji w tych komórkach. Przeciwnie, gdy ulegał ekspresji zmutowany cDNA pacjenta, obserwowano podobny fenotyp LLO, jak stwierdzono w fibroblastach pacjenta (Figura 6c, cDNA pacjenta). Poziomy mRNA ludzkiej wiadomości MPDU1 w obu liniach komórkowych analizowano metodą PCR w czasie rzeczywistym, stosując aktynę jako wewnętrzny standard i były one porównywalne w obu liniach komórkowych (nie pokazano). Figura 6LLO profilu stabilnych transfektantów i kontroli CHO MPDU1 / Lec35. Komórki Lec35.1 pTet-Off transfekowano pustym wektorem (a), normalnym allelem Lec35 (b) lub allelu MPDU1 pacjenta (c). (d) Wyniki dla rodzicielskich komórek CHO typu dzikiego
[przypisy: atrakcje turystyczne karpacz, ból przy oddawaniu stolca, o czym rozmawiać z dziewczyną na pierwszym spotkaniu ]
[patrz też: migotanie przedsionków przyczyny, malowanie włosów w ciąży, wojsko gedeona ]
